做方法開發(fā)的小伙伴們經(jīng)常會(huì)遇到這樣的情況,，我們拿到一個(gè)樣品后,，得知了樣品的部分屬性，但是在選擇色譜柱上面卻無從下手,。

因?yàn)?strong>色譜柱的種類千差萬別,，在USP（美國藥典）中色譜柱分類從L1-L46，竟然有這么多,，我究竟該選擇哪一種色譜柱才更適合我呢？

色譜柱種類很多,，而且每個(gè)廠家的色譜柱也不一樣,，有時(shí)候同樣是C18的色譜柱，不同廠家的色譜柱之間也會(huì)有差別,，我們要想選擇合適的色譜柱,，就需要對(duì)色譜柱的分類和內(nèi)在性質(zhì)有所了解

液相色譜柱常用的分類方法為按照用途劃分，可以分為以下幾類：

1.  反相柱RP（C18,、C8,、C4/C3）

2.  正相柱NP

3.  尺寸排阻柱（SEC）

4.  離子交換柱（IEX）

5.  親水相互作用柱（HILIC）

我們下面針對(duì)這幾種色譜柱逐一進(jìn)行講解：

一、反相柱（RP,，Reversed Phase）

反相柱是實(shí)驗(yàn)室使用廣泛的色譜柱,，它是以硅膠填料為基礎(chǔ),，中間鍵合了極性相對(duì)較弱的官能團(tuán)鍵合相，流動(dòng)相一般為極性較強(qiáng)的有機(jī)相（甲醇,、乙腈）,。

溶質(zhì)按其疏水性大小進(jìn)行分離，極性越大疏水性越小的溶質(zhì),，越不易與非極性的固定相結(jié)合,，所以先被洗脫下來。

而極性較小疏水性較大的物質(zhì),，就被保留下來,，隨著有機(jī)相比例增大，被依次洗脫下來,。

反相柱也有很多亞類,，按照碳鏈的長短可以分為C18、C8,、C4/C3,。我們常說的ODS就是C18色譜柱（Octadecylsilyl，十八烷基硅烷鍵合硅膠填料）,，這種色譜柱常用來分析化學(xué)小分子物質(zhì),，在生物制藥領(lǐng)域多用來進(jìn)行氨基酸分析、多肽分析（<10KD）,，肽圖分析等,。

使用C18色譜柱需要注意的是，C18色譜柱能夠耐受的pH值一般在3-8之間,， 過低或者過高的pH值都會(huì)損壞色譜柱,，造成硅膠溶解。

有些C18色譜柱能夠耐受的pH低至1,，這些色譜柱往往是在C18硅膠填料的基礎(chǔ)上進(jìn)行了化學(xué)修飾形成的,，值得一提的是Waters的BEH（亞乙級(jí)橋雜化技術(shù)），高pH條件下柱穩(wěn)定性的強(qiáng)化測(cè)試結(jié)果表明柱壽命比超純硅膠柱提高十倍以上,，能夠顯著提高色譜柱的酸堿耐受性,。

此外，高鹽溶液（>0.5M）也容易造成一定的硅膠填料溶解,，所以鹽溶液在分析過程中盡量要控制濃度,，而且在與有機(jī)相進(jìn)行混合的時(shí)候，比例要緩慢改變,，否則容易造成鹽的沉淀堵塞色譜柱,。

上述pH與高鹽溶液都是對(duì)色譜柱具有不可逆破壞的物質(zhì)，此外還有一些物質(zhì)也會(huì)對(duì)色譜柱造成影響,，但是可以經(jīng)過一定的方法進(jìn)行清洗再生,。

一些添加劑會(huì)造成峰型改變,，例如SDS、吐溫,、Triton等,，可能造成柱壓升高，需要多沖沖柱子才能解決,。

此外,，C18的色譜柱也盡量不要使用純水相，否則可能造成疏水塌陷,，影響色譜柱的保留特性,。

如果出現(xiàn)疏水塌陷，需要使用高比例有機(jī)相過夜沖洗,，可以進(jìn)行恢復(fù),。

C8和C4（有的廠家會(huì)出C3）色譜柱一般是針對(duì)大蛋白或者單抗的，碳鏈越短,，對(duì)分子量較大的蛋白分析越有利,。單抗一般選擇C4色譜柱，抗原或者單抗亞基（LC&HC）可以選擇C8色譜柱進(jìn)行分析,。值得一提的是分子量較大的蛋白在反相柱上都會(huì)有一定的殘留,，這時(shí)候我們需要采取一定的措施較少殘留，不讓殘留在下一樣品上形成鬼峰,。一般采取的措施是每個(gè)樣品之間走一個(gè)空白,，并且提高色譜柱的柱溫至70-80℃。流動(dòng)相的pH對(duì)樣品溶質(zhì)的電離狀態(tài)影響也很大,，進(jìn)而影響其疏水性,，所以在分離肽類和蛋白質(zhì)等生物大分子的過程中，經(jīng)常要加入修飾性的離子對(duì)物質(zhì),，常用的離子對(duì)試劑是三氟乙酸（TFA）,，使用濃度為0.1%，使流動(dòng)相的pH值為2～3,，這樣可以有效地抑制氨基酸上α羧基的離解,，使其疏水性增加，延長洗脫時(shí)間,，提高分辨率和分離效果。

除此之外,，還可以嘗試磷酸,、醋酸、甲酸,。

二,、正相柱（NP,，Normal Phase）

正相柱與反相柱相似，也是以硅膠填料為基礎(chǔ),，但是正相柱上鍵合的是極性相對(duì)較強(qiáng)的官能團(tuán)鍵合相（如帶有二醇基,、氨基、和氰基的固定相及硅膠,、三氧化二鋁等）,，流動(dòng)相一般為極性較弱的正己烷等物質(zhì)。簡單來說,，如果采用固定相的極性大于流動(dòng)相的極性,，就稱為正相色譜；如果固定相的極性小于流動(dòng)相的極性,，則稱為反相色譜,。

正相色譜一般用來分離中性化合物和離子化合物，主要以中性樣品為主,。正相色譜分析的樣品有以下幾種：異構(gòu)體,、族類分離、易水解樣品,、高脂溶性樣品,。我們所知的氨基柱和氰基柱（官能團(tuán)為－CN氰基、－NH2氨基）在正相色譜上使用都很多,。

三,、尺寸排阻柱（SEC，Size Exclusion Column）

尺寸排阻色譜柱（SEC）是根據(jù)蛋白的分子量大小進(jìn)行分離的一種色譜柱,，采用的是多孔硅膠填料,，分子量小的物質(zhì)能夠進(jìn)入到硅膠孔內(nèi)，走的路程多,，分子量大的物質(zhì)被排阻在硅膠孔外,，走的路程少。于是分子量大的物質(zhì)就先流出,，分子量小的物質(zhì)后流出,，通過這種方法就可以將蛋白分離開了。

SEC色譜柱主要用于分析蛋白的聚集體狀態(tài),，在生物制藥領(lǐng)域蛋白質(zhì)聚集體是需要嚴(yán)格控制的一個(gè)檢項(xiàng),，因?yàn)榫奂w很可能會(huì)產(chǎn)生免疫原性，造成藥物的過敏反應(yīng),。SEC可以很好的針對(duì)單抗,，抗原等物質(zhì)進(jìn)行分析，分離出降解片段，單體,，二聚體及多聚體,。SEC色譜柱也有很多亞類，根據(jù)填料的孔徑大小分類,，可以分為1000A,，300A和150A等幾類。300A孔徑的色譜柱經(jīng)常用來分析單抗以及雙特異性抗體,，這類色譜柱的分離范圍在30kd-200kd之間,。1000A的色譜柱填料孔徑較大，適合分離大于200kd的大蛋白,，以及一些ADC藥物,。而150A的色譜柱填料孔徑較小，適合分離抗原或者多肽類藥物,，它的分離范圍在5kd-60kd之間,。所以我們可以根據(jù)樣品的分子量大小選擇合適的色譜柱進(jìn)行分離，值得一提的是SEC色譜柱基于它的特殊填料處理方式,，似的硅膠顆?；静慌c蛋白發(fā)生相互作用，所以SEC色譜柱分離大蛋白不會(huì)產(chǎn)生蛋白殘留,，是一種理想的單抗分離手段,。

SEC色譜柱一般使用緩沖鹽作為流動(dòng)相，常用的是PBS（磷酸鹽緩沖液）,，相對(duì)于其他種類色譜柱,，SEC色譜柱的壽命是比較短的。在SEC色譜柱使用久了以后會(huì)產(chǎn)生拖尾,，或者峰展寬的情況,，這時(shí)候我們可以對(duì)SEC色譜柱進(jìn)行再生清洗。一般再生的方法有幾種,，可以根據(jù)需要結(jié)合起來使用：

1.    10%-20%甲醇低流速（正常流速的30%）沖洗15-20個(gè)CV（柱體積,，column volume）

2.    0.25M Na2SO4或者NaCl沖洗5CV，純水沖洗5CV,，交替沖洗2次,。

3.    5%異丙醇（IPA）沖洗5CV，沖洗過程中可以滿環(huán)進(jìn)樣6M鹽酸胍或者8M尿素,，確保色譜柱上殘留蛋白的變性,。

以上方法沖洗可以對(duì)色譜柱進(jìn)行再生，如果效果不是太好,，可以嘗試進(jìn)行反沖,，但是對(duì)于亞2微米的色譜柱,，不可以進(jìn)行反沖,，否則填料就會(huì)流失,。如果進(jìn)行了反沖，建議以后色譜柱反著使用,，因?yàn)榉礇_后的色譜柱整體結(jié)構(gòu)有一定損壞,，雖然暫時(shí)性能提升了，但是柱效的下降要比新柱子快很多,，所以反沖盡量要慎重選擇,。

有時(shí)候峰型變差可能是由于蛋白引起的，我們換一個(gè)樣品之后就好了,，這是因?yàn)镾EC色譜柱雖然是消除了蛋白與色譜柱的相互作用,，但是現(xiàn)有技術(shù)無法做到100%消除這種作用，對(duì)于某些蛋白仍然是會(huì)有一定相互作用的,。這時(shí)候我們?cè)诜治鲞^程中可以添加精氨酸或者2%的IPA,，或者加入150mM NaCl去減弱這種相互作用，可以改善峰型,。

如果上述方法都沒有效果,，那么我們可能需要更換一根新的色譜柱了。在以后的分析過程中,，我們可以增加一根保護(hù)柱（guard column）或者加上在線濾器（online filter）,，都可以有效延長SEC色譜柱的壽命。

四,、離子交換柱（IEX,，ion exchange）

離子交換色譜柱在硅膠基質(zhì)的固定相上鍵合SO3-、COO-,、NH3+等離子官能團(tuán),，使固定相帶上電荷。這種電荷與流動(dòng)相中相反電荷的離子中和,。當(dāng)樣品帶有與固定相相反的電荷時(shí),，就被固定相抓取，隨著流動(dòng)相中相反電荷增加,，與樣品競(jìng)爭(zhēng)性的和固定相結(jié)合,，這樣就把樣品從固定相上取代下來，流出色譜柱,。

離子交換柱按固定相電荷種類不同可以分為陽離子交換柱（CEX）,，陰離子交換柱（AEX）。其中陽離子交換柱固定相上鍵合陰離子基團(tuán),，又分為強(qiáng)陽離子交換柱（SCX）和弱陽離子交換柱（WCX）,；陰離子交換柱固定相上鍵合陽離子基團(tuán),，又分為強(qiáng)陰離子交換柱（SAX）和弱陰離子交換柱（WAX）。生物制藥領(lǐng)域多使用弱陽離子交換柱（WCX）,，這是因?yàn)樯镏扑庒槍?duì)大蛋白,，且蛋白的等電點(diǎn)一般在中性左右，故使用比蛋白等電點(diǎn)低1個(gè)單位的WCX更加合適,。

WCX色譜柱主要用來進(jìn)行電荷異構(gòu)體的分析,，根據(jù)不同的電荷異質(zhì)性，我們可以得到相關(guān)的酸性峰,，主峰和兩個(gè)堿性峰,。再結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，我們可以發(fā)現(xiàn)2個(gè)堿性峰是單抗的末端賴氨酸（Lys）引起的,，主峰是缺失兩個(gè)Lys形成的,，酸性峰是脫酰胺造成的。

WCX方法的優(yōu)化可以使用鹽梯度進(jìn)行,，也可以使用pH梯度進(jìn)行,，每家的儀器都有相關(guān)的離子交換方法開發(fā)軟件，方便我們對(duì)離子交換的溶液配制以及梯度調(diào)整,，這里不再一一說明,。

五、親水相互作用柱（HILIC,，Hydrophilic Interaction column）

HILIC色譜柱是以硅膠基質(zhì),，鍵合強(qiáng)親水性的極性官能團(tuán)，利用水相和有機(jī)相作為流動(dòng)相的一類色譜柱,。HILIC色譜柱的使用方式和反相RP色譜柱正好相反,，初始是較高的有機(jī)相，然后不斷的增加水相比例,，將極性較強(qiáng)的物質(zhì)依次洗脫下來,。

HILIC色譜柱在生物制藥領(lǐng)域主要用于糖基化（Glycosylation）的分析。糖基化是真核細(xì)胞（酵母,、CHO）蛋白翻譯后修飾（PTM）的重要方式,，糖基化的差異可能直接導(dǎo)致細(xì)胞的ADCC（抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用）、CDC（補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用）,，以及一些免疫過敏反應(yīng)（非人源化唾液酸NGNA）,，所以HILIC色譜柱進(jìn)行糖基化檢測(cè)被廣泛應(yīng)用在生物制藥領(lǐng)域。

常見的色譜柱就是這些啦,，在生物制藥領(lǐng)域主要使用RP,、SEC、IEX,、HILIC這幾種色譜柱,，大家把這幾種色譜柱的主要使用環(huán)境牢記于心,，在方法開發(fā)的時(shí)候就能夠游刃有余，選擇出適合自己分析的色譜柱了,。