HPLC和LC/MS 緩沖液選擇指南：注意事項(xiàng)

為了持續(xù)獲得高品質(zhì)的結(jié)果,，應(yīng)例行采用一些技術(shù),。

首先，使用效果最優(yōu)的試劑,，大多數(shù)緩沖液成分在HPLC級可用,。

相較于等度方法,，梯度洗脫分離更注重緩沖液的純度,。

隨著檢測限度的降低，一些與試劑相關(guān)的問題變得越來越重要,。

可參見圖5[8],。非注射空白梯度是檢查雜質(zhì)的方法之一。

根據(jù)圖5a可見,，基線顯示出多個(gè)大于10mAU的峰值,。

對于0.8到1AU峰值范圍的試驗(yàn)，這種雜質(zhì)峰可以忽略不計(jì),；但對于該應(yīng)用,，樣品應(yīng)含有定量的5-10mAU的峰值。

如圖5a所示,，臟的空白梯度通常是因?yàn)樗蛟噭┦艿轿廴尽?

這種情況下多由緩沖液的制備方法引起,。

如果通過將pH計(jì)探針浸入大量流動相來檢測pH值，則圖5a的結(jié)果將十分典型,。

另一種方法是：去除部分流動相并檢測其pH值,，然后丟棄這部分溶劑,，得到圖5b所示的空白梯度。

由此可以看出,，圖5a的額外峰值主要來源于pH探針,。

對于具有較大敏感度的流動相，特別是在<220nm的UV波長下,，應(yīng)避免pH探針接觸大量的流動相,。

使用緩沖液時(shí)，還應(yīng)在制備完成后對緩沖液進(jìn)行過濾,。

盡管緩沖液是化學(xué)純粹試劑,，但在制備緩沖液的過程中，它可能會沾染灰塵,，或因刮擦滲入緩沖瓶蓋內(nèi)襯中的顆粒物或鹽沉淀,。

因此，使用前應(yīng)使用0.5m孔隙度的過濾器對緩沖液進(jìn)行過濾,。

圖5pH-探針對緩沖液的污染情況

（a）與pH探針接觸后制備的緩沖液的空白梯度,；

（b）不接觸探針。改編自[8],。

緩沖液非常容易滋生微生物,，因此應(yīng)特別注意消除可能滋生微生物的條件。

重新注入前應(yīng)清洗容器,。

為未使用的緩沖液設(shè)置合理的有效期限,，并在到期時(shí)廢棄。

雖然您可能在更長時(shí)間內(nèi)保持緩沖液的穩(wěn)定性,，但是對于稀釋的緩沖液（例如<50mM）,，許多實(shí)驗(yàn)室會指定一周的使用期限，以避免微生物的滋生,。

用于LC-MS的揮發(fā)性緩沖液（例如碳酸氫銨）,，由于揮發(fā)導(dǎo)致的損失，其pH值會隨時(shí)間而改變,。因此,，這種緩沖液最好每天制備。

請勿在未洗凈緩沖液的情況下,，長時(shí)間關(guān)閉HPLC系統(tǒng)（如超過幾個(gè)小時(shí)）,。

如果將緩沖液留在未使用的HPLC系統(tǒng)中，則泵或其它組件中會產(chǎn)生緩沖液沉淀或滋生微生物,。

如需切換至水/有機(jī)流動相（如用50/50水/MeOH代替50/50緩沖液/MeOH）,，首先用10-20mL沖洗系統(tǒng)，以去除緩沖液,，然后再使用強(qiáng)溶劑沖洗,，進(jìn)而去除色譜柱中的頑固殘留,。

使用反相色譜柱時(shí)，用100％的水沖洗無法有效去除的緩沖液,，許多固定相會用100％的水去濕（有時(shí)稱為了“固定相塌陷”）,，從而破壞清洗過程。

然而,，“高含水量”或“AQ”類型的相可以用100％的水沖洗,，且不會產(chǎn)生去濕問題。