色譜柱可分為填充柱和開管柱兩大類,。多為金屬或玻璃制作。有直管形,、盤管形,、U形管等形狀。液相色譜通常均采用填充柱,。

色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相,，以及色譜柱的制備和操作條件。

色譜是一種分離分析手段,，分離是核心,，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟,。對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好,，分析速度快等,。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁,、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹脂）,、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等,，柱效理論值可達(dá)5~16萬(wàn)/米,。對(duì)于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對(duì)于同系物分析,，只要500即可,；對(duì)于較難分離物質(zhì)對(duì)則可采用高達(dá)2萬(wàn)的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長(zhǎng)就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要,。

柱效受柱內(nèi)外因素影響,，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外,，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù),。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的,，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流,，流速較快,，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬,，這就是管壁效應(yīng),。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中,，柱外效應(yīng)對(duì)柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng),。

色譜柱由柱管、壓帽,、卡套（密封環(huán)）,、篩板（濾片）、接頭,、螺絲等組成,。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm² 時(shí),，也可采用厚壁玻璃或石英管,，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度,。為提高柱效，減小管壁效應(yīng),，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光,。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同,。還有使用熔融硅或玻璃襯里的,，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板,，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金,，孔徑0.2~20μm（5~10&μm），取決于填料粒度,，目的是防止填料漏出,。

色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：

①常規(guī)分析柱（常量柱）,，內(nèi)徑2~5mm（常用4.6mm,，國(guó)內(nèi)有4mm和5mm），柱長(zhǎng)10~30cm,；

②窄徑柱（narrow bore,，又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn）,，內(nèi)徑1~2mm,，柱長(zhǎng)10~20cm；

③毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn）,，內(nèi)徑0.2~0.5mm,；

④半制備柱，內(nèi)徑>5mm,；

⑤實(shí)驗(yàn)室制備柱,，內(nèi)徑20~40mm，柱長(zhǎng)10~30cm,；

⑥生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米,。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長(zhǎng)、填料粒徑和折合流速來確定,，目的是為了避免管壁效應(yīng),。

常見的分配柱填料：碳十八柱 ^[1]（ODS/C18)、碳八柱（MOS/C8）,、碳六柱（Hexyl/C6）,、碳四柱（Butyl/C4）、碳一柱（Methyl/C1）,、陰離子交換柱（SAX),、陽(yáng)離子交換柱（SCX）,、苯基柱（Phenyl）、氨基柱（Amino/NH2）,、氰基柱（Cyano/CN/Nitrile）

常見的吸附柱填料：硅膠柱

1,、首先應(yīng)確認(rèn)柱和儀器的接頭以及管路是否匹配。為減少死體積,，進(jìn)樣閥,、柱子、檢測(cè)器之間的連接管路內(nèi)徑盡可能使用內(nèi)徑較小的管線,，同時(shí)控制進(jìn)樣器,、色譜柱和檢測(cè)器之間連接管線的長(zhǎng)度。安裝色譜柱之前,，確認(rèn)流路系統(tǒng)中的溶劑是否正常,。對(duì)分析較復(fù)雜的樣品建議安裝保護(hù)柱。

2,、為了使色譜柱與儀器系統(tǒng)達(dá)最佳的連接效果,，應(yīng)盡量使用與色譜柱接口相匹配的螺帽和錐形接頭，如原來的接頭長(zhǎng)期匹配其他類型的色譜柱,，建議在連接新色譜柱前應(yīng)檢查匹配情況,，避免造成色譜柱的損壞或因色譜柱不匹配造成的漏液。

3,、使用PEEK 材料的通用接頭,，只需用手?jǐn)Q緊不需要特定扳手，使用壓力為5000psi,；使用溫度不得超過100℃,。

1、在進(jìn)行樣品檢測(cè)前,，至少使用20倍柱體積流動(dòng)相使色譜柱充分平衡。流動(dòng)相一定要使用色譜級(jí)別的溶劑,。如使用水相的緩沖液應(yīng)當(dāng)天配制以保持新鮮避免細(xì)菌產(chǎn)生,。

2、流動(dòng)相使用前需用微孔濾膜過濾,消除流動(dòng)相中顆粒對(duì)色譜系統(tǒng)和色譜柱的損壞,。緩沖液與其他流動(dòng)相混合后應(yīng)重新過濾避免溶解度變化造成產(chǎn)生新的沉淀,。不應(yīng)使用純水作為流動(dòng)相沖洗C18色譜柱，以免柱性能損壞（添加5%的有機(jī)溶劑沖洗色譜柱,，同時(shí)可以達(dá)到對(duì)緩沖鹽清洗的作用,。還可以使色譜柱更容易平衡）。

3,、流動(dòng)相需脫氣后使用,，可避免因氣泡導(dǎo)致的泵和檢測(cè)器的工作不正常,。如果測(cè)試時(shí)使用的流動(dòng)相與色譜柱保存使用的流動(dòng)相有較大區(qū)別，應(yīng)該使用過度分布的形式進(jìn)行平衡,。避免由于流動(dòng)相的突然變化造成柱壓增加過大或流動(dòng)相緩沖鹽結(jié)晶造成對(duì)色譜柱和儀器系統(tǒng)的損壞,。正相色譜柱比反相色譜柱需要更長(zhǎng)的平衡時(shí)間。

1,、樣品應(yīng)當(dāng)盡可能溶解在能與流動(dòng)相相互溶的溶劑中,。除特殊指明外，如使用強(qiáng)溶劑溶解樣品柱子的分辨率將可能降低,。

2,、樣品溶液在進(jìn)樣前應(yīng)使用針頭式過濾器對(duì)樣品預(yù)先過濾。頻繁改變流動(dòng)相組成,，會(huì)加速降低柱效,。

3、色譜柱由高壓勻漿法裝填,，能承受較高壓力,。為獲得最佳分離效果，使用時(shí)請(qǐng)不要超過200kgf,，而且避免壓力突然上升或變化,，否則會(huì)造成硅膠填料的破壞，減少色譜柱的使用壽命,。除特殊要求外最高操作溫度不要超過60℃,。

1、如果流動(dòng)相含有酸或無(wú)機(jī)鹽,，應(yīng)當(dāng)先用去離子水（20倍柱體積）沖洗干凈,。然后用用100%乙腈或甲醇保存色譜柱。最后用柱子的接頭密封,，并放在穩(wěn)定的環(huán)境中存放,。

2、應(yīng)避免色譜柱受到直接的機(jī)械沖擊或摔落,，避免造成色譜柱性能的降低。

用相當(dāng)于20倍柱體積的溶劑按下列順序沖洗柱子,，建議按柱子的箭頭方向沖洗,，盡可能不反沖。沖洗時(shí)使用的的參考溶劑順序是水,、甲醇,、氯仿、異丙醇。

色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外,，還與填充技術(shù)有關(guān),。在正常條件下，填料粒度>20μm時(shí),，干法填充制備柱較為合適,；顆粒<20μm時(shí)，濕法填充較為理想,。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法,，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；②徑向加壓法,，Waters專利,；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱,；④干法,。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱,。

必須指出,，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié),，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣,，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。

無(wú)論是自己裝填的還是購(gòu)買的色譜柱,，使用前都要對(duì)其性能進(jìn)行考察,，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品,、流動(dòng)相,、流速、溫度）下的柱壓,、理論塔板高度和塔板數(shù),、對(duì)稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性,，或分離度,。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以內(nèi)。進(jìn)行柱效比較時(shí),，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化,。

一份合格的色譜柱評(píng)價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù),，如柱長(zhǎng),、內(nèi)徑、填料的種類、粒度,、色譜柱的柱效,、不對(duì)稱度和柱壓降等。

色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要,，稍有不慎就會(huì)降低柱效,、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中,，需要注意下列問題,，以維護(hù)色譜柱。 ^[2] 

①　避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng),。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況,；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行,，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩（如前所述）,。

②　應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中,，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?

③　一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí),，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì),。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。

④　選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH）,，以避免固定相被破壞,。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí),，預(yù)柱為硅膠,，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解,。

⑤　避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi),，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱,。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換,。

⑥　經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì),。在進(jìn)行清洗時(shí),，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右,，即常規(guī)分析需要50~75ml,。

下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序,，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗,，然后再以相反順序依次沖洗,，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì),，已烷使硅膠表面重新活化,。反相柱以水、甲醇,、乙腈,、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗,。如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液,，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì),，在甲醇（乙腈）沖洗時(shí)重復(fù)注射100~200μl四氫呋喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì),。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次,。此外,，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染,。

陽(yáng)離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗,，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽,，然后用水,、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機(jī)物）,、甲醇,、水依次沖洗。

⑦　保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇,，柱接頭要擰緊,，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長(zhǎng)時(shí)間,。

⑧　色譜柱使用過程中,，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞,，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗,；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染,；如果柱效降低或色譜峰變形,，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,，死體積增大。

在后兩種情況發(fā)生時(shí),，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平,。然后用適當(dāng)溶劑濕潤(rùn)的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿色譜柱,，壓平，再擰緊柱接頭,。這樣處理后柱效能得到改善,，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。

柱子失效通常是柱端部分,，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm）,，可以起到保護(hù)、延長(zhǎng)柱壽命的作用,。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效,，這是值得的。

通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上,。以硅膠為基質(zhì)的填料,，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時(shí)間后,，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂,，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙稀Ｐ碌纳V柱在使用一段時(shí)間后柱頂填料可能塌陷,，使柱效下降,，這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)。

每次工作完后,，最好用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗,，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí),，使用完后應(yīng)用無(wú)鹽流動(dòng)相沖洗,。含鹵族元素（氟、氯,、溴）的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道,，不宜長(zhǎng)期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用,，應(yīng)每隔4~5天開機(jī)沖洗15分鐘,。

1、石墨化碳填料

硅膠的化學(xué)穩(wěn)定性較差,，僅能在pH=2~8的環(huán)境下工作,。但是,，在很多場(chǎng)合下，需要使用極端的pH條件,。為此,，人們?cè)罅Πl(fā)展高分子微球、氧化鋁,、氧化鋯等化學(xué)穩(wěn)定性更好的基質(zhì)材料,。但是，很難有一種材料能全面地滿足液相色譜基質(zhì)的要求,。例如,，高分子微球在有機(jī)溶劑中會(huì)發(fā)生一些溶脹，因此難以應(yīng)用于以含有機(jī)溶劑的流動(dòng)相進(jìn)行梯度淋洗的場(chǎng)合,；氧化鋁和氧化鋯與硅膠相比,，雖然化學(xué)穩(wěn)定性較好，但其表面修飾與鍵合比較困難,。因此,，化學(xué)穩(wěn)定性好的碳材料便很自然地被考慮作為色譜填料的基質(zhì)。

碳材料有極好的化學(xué)穩(wěn)定性,，可耐受寬達(dá)pH=1~14的環(huán)境,；耐高溫，石墨化碳可耐3000℃以上的高溫而不受破壞,；經(jīng)適當(dāng)加工的碳材料可具有很好的機(jī)械強(qiáng)度,，具有優(yōu)良的導(dǎo)電性、導(dǎo)熱性及電磁屏蔽特性,。更為難能可貴的是,，多孔性碳材料以其結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)而具有很好的吸附性及選擇性。正是碳材料的這些特性,，使人們期待它在色譜領(lǐng)域中能有特殊的用途,。

2、貫流色譜填料

貫流色譜是20世紀(jì)80年代末至90年代初發(fā)展起來的一種色譜分離新方法,。在這種填料上,，既有通常的微孔或大孔，例如50~150nm的微孔,，又有貫穿整個(gè)顆粒的,，孔徑約600~800nm超大孔存在。這種貫穿的大孔,，可以允許流動(dòng)相直接進(jìn)入填料顆粒的內(nèi)部并貫穿而過,。這樣，就相當(dāng)于極大地降低了填料顆粒的直徑,，即以貫穿孔將填料分割成了很多更細(xì)小的顆粒,，在這種小顆粒上的微孔已經(jīng)短到不對(duì)傳質(zhì)過程構(gòu)成明顯的阻力,。因此，在這種貫流色譜填料上,，傳質(zhì)阻力已經(jīng)非常小,。同時(shí)，貫穿孔內(nèi)流動(dòng)相的線速度正比于柱子中流動(dòng)相的速度,，即傳質(zhì)過程已由擴(kuò)散傳質(zhì)變?yōu)閷?duì)流傳質(zhì),。這就意味著，在一定范圍內(nèi),，及時(shí)提高流動(dòng)相速度，也不會(huì)降低柱子的分離效率,。由于填料上同時(shí)還存在有通常的多孔結(jié)構(gòu),，其比表面積并未隨貫穿孔的出現(xiàn)而大幅度降低。

因此,，在這種填料上的樣品負(fù)載量也不隨流速的增加而減少,。再者，填料上600~800nm的貫穿孔,，極大地增加了柱子的通透性,，使得這種柱子即使工作于很高的流速下，其操作壓力也不需要很高,。所以,，這種貫流色譜柱可以同時(shí)具有高流速、高效率,、高樣品負(fù)載量和低操作壓力的特點(diǎn),。

3、整體柱

整體柱又稱整體固定相,、棒柱,、連續(xù)床等，是在柱管內(nèi)原位聚合或固定化了的連續(xù)整體多孔結(jié)構(gòu),，可根據(jù)需要對(duì)整體材料的表面作相應(yīng)的衍生化,，是一種新型的用于分離分析或作為反應(yīng)器的多孔介質(zhì)。通過控制聚合條件來得到具有理想孔徑分布的整體柱,。整體柱中的空間由聚合物顆粒中的孔和顆粒間的縫隙組成,，分離在樣品流經(jīng)孔結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)生?？梢詼p少路徑的差異和縱向擴(kuò)展,。

整體柱的優(yōu)點(diǎn)包括：可以原位制備，省去制備填料和裝柱,，也可以同法制成聚合物顆粒后再裝柱,；聚合物易于制備,，柱子的長(zhǎng)度和直徑在一定程度上不受限制；聚合反應(yīng)混合物中的單體可以靈活選擇以得到適合的基質(zhì)和性質(zhì),；易于在柱衍生化,，以得到具有合適性質(zhì)的色譜柱；通過控制聚合反應(yīng)的條件可以優(yōu)化孔的性狀,。