高效液相色譜(HPLC)是20世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來的分離分析技術(shù),，是現(xiàn)代分離測(cè)定的重要手段,。問世以來,，因其具有分離效能高,、分析速度快、檢測(cè)靈敏度好,、能分析高沸點(diǎn)但不能氣化的熱不穩(wěn)定生理活性 物質(zhì)的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué),、藥物及臨床分析。
高效液相色譜是用高壓輸液泵將具有不同極性的 單一溶劑或不同比例的混合溶劑,，緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱,，經(jīng)進(jìn)樣閥注入待測(cè)樣品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi),，在柱內(nèi)各成分被分離后依次進(jìn)入檢測(cè)器,，色譜信號(hào)由記錄儀、積分儀或色譜工作站記錄,。
色譜柱是高效液相色譜的心臟,，在高效液相色譜儀的使用中，保持色譜柱的柱效,、容量和滲透粉性,，延長(zhǎng) 柱子的使用壽命非常重要。因此對(duì)高效液相色譜柱的維護(hù)是關(guān)鍵,。
1色譜柱的構(gòu)造
色譜柱由柱管,、壓帽、卡套(密封環(huán)),、篩板(濾片),、接頭、螺絲等組成,。柱管多用不銹鋼制成,，壓力不高于70㎏/㎝2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管,，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度,。
為提高柱效，減小管壁效應(yīng),，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光,。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱,。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板,，是燒結(jié)不銹鋼或欽合金，孔徑0.2-20 μm(5-10μm),，取決于填料粒度,，目的是防止填料漏出。
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同:
(I)常規(guī)分析柱(常量柱),，內(nèi)徑2-5mm(常用4.6mm,，國(guó)內(nèi)有4mm和5mm )，柱長(zhǎng)10-30cm ;
(2)窄徑柱,，又稱細(xì)管徑柱,、半微柱，內(nèi)徑1 -2mm ,柱長(zhǎng)10-20cm;
(3)毛細(xì)管柱(又稱微柱),，內(nèi)徑0.2-0.5mm;
(4)半制備柱,，內(nèi)徑>5mm;
(5)實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑20-40rnm,，柱長(zhǎng)10-30cm;
(6)生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米,。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長(zhǎng)、填料粒徑和折合流速來確定,，目的是為了避免管壁效應(yīng),。
2色譜柱的使用和維護(hù)
在日常分離分析工作中，色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要,，色譜柱使用是否得當(dāng),，直接影響色譜柱的壽命，稍有不慎就會(huì)降低柱效,、縮短使用壽命甚至損壞,。在色譜操作過程中，需要注意下列問題,，以維護(hù)色譜柱,。
(1)柱子在裝卸、更換時(shí),，動(dòng)作要輕,，接頭擰緊要適度。必須防止較強(qiáng)的機(jī)械振動(dòng),，以免柱床產(chǎn)生空隙,。
(2)如果儀器用來做常規(guī)分析，樣品種類有限,，但分析次數(shù)多,，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱，這樣有助于延長(zhǎng)柱子的壽命,。
(3)避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng),。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行,，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩,。
(4)應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?
(5)如使用柱溫控制裝置時(shí)，應(yīng)注意在通人流動(dòng)相后才能升溫,。
(6)一般說來色譜柱不能反沖,，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì),。否則反沖會(huì)迅速降低柱效,。
(7)選擇使用適宜的流動(dòng)相，以避免固定相被破壞,。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一個(gè)預(yù)柱,，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠,，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”,，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
(8)避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi),，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一個(gè)保護(hù)柱,。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換,。
(9)經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱,，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí),，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡,，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50-75mL,。
(10)保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇,，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥,。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長(zhǎng)時(shí)間,。
(11)色譜柱使用過程中，如果壓力升高,，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞,，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)人柱內(nèi)，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形,，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,，死體積增大。
(12)在完成分離分析工作之后,，不應(yīng)立即停機(jī),，需及時(shí)對(duì)色譜分析系統(tǒng)進(jìn)行沖洗，一般0.5h以上，以除去色譜柱內(nèi)的雜質(zhì),。
