樣品稀釋劑在HILIC中的重要性
引言
當(dāng)使用親水相互作用液相色譜法(HILIC)時,,樣品稀釋劑的選擇對峰形有顯著的影響。稀釋劑的錯誤選擇可能會導(dǎo)致色譜峰形差,,峰分裂和保留時間的不穩(wěn)定,。
這張ACE知識卡片探討了在HILIC方法開發(fā)過程中如何確定合適的稀釋劑。
樣品稀釋劑與峰形
理想情況下,,HILIC模式下樣品的稀釋劑應(yīng)該盡可能的接近分離化合物的流動相組成,,即稀釋劑由高比例的弱溶劑組成,如乙腈,。對HILIC模式下梯度洗脫,,樣品稀釋劑應(yīng)該類似梯度方法流動相的起始條件。在某些情況下,,可能會出現(xiàn)這種情況,,極性化合物的樣品溶解度問題:在HILIC中可能會遇到分析物相對不溶于高濃度的有機溶劑。
有時候,,遇到HILIC峰形問題可以通過樣品稀釋劑的選擇來解決,。樣品溶解在含高水稀釋劑中是否為問題源頭,因為水是強溶劑,,洗脫能力強,。樣品被大量水包圍,破壞了化合物分配到HILIC固定相表面富水層的機制,。這就導(dǎo)致了化合物較差的峰形和保留時間的不穩(wěn)定,,尤其是保留較弱的化合物。圖1 顯示了2-脫氧尿苷分別用流動相和水做稀釋劑獲得的峰形圖,。當(dāng)被分析物溶解在水里,,觀察到峰寬很大,幾乎裂開的峰,。通過用流動相來改變樣品的稀釋液,,峰的形狀和信號強度得到顯著的改善。
HILIC色譜法,,樣品的稀釋劑選擇視具體應(yīng)用而定,,因此在方法開發(fā)中,應(yīng)分配資源研究樣品稀釋劑的影響,,通常是稀釋劑的作用強度影響可能依賴于分析物,,還受固定相和洗脫液的條件的影響。因此建議進行分步調(diào)查來探究提高有機溶劑的比例對于峰形和方法的影響,。在50 - 90%乙腈中以增加10%的乙腈量增加:緩沖液可以幫助理解如何實現(xiàn)目標(biāo)分析物的最佳峰形,。
圖1.樣品稀釋劑對于2-脫氧尿苷峰形的影響
色譜柱:ACE 5 HILIC-N, 150 x4.6mm.流速:1.5mL/min。流動相:10 mM 甲酸銨 pH4.7 in乙腈:水=9:1,。進樣量:5uL.,。溫度:25℃,。 檢測器:UV,254nm,。
圖2顯示了在流動相pH 3.0 條件下,,堿性、酸性和中性分析物的樣品稀釋劑對于三個ACE HILIC固定相(ACE HILIC-A,、ACE HILIC-B,、ACE HILIC-N)的影響的研究結(jié)果。樣品稀釋劑為乙腈和水的混合溶液,,水的百分率介于0-100%之間,。
次黃嘌呤(極性中性)的峰形一般隨著乙腈濃度的增加而改善,最佳的有機溶劑含量在60-80%左右,。酪胺(堿性)在低百分比有機相稀釋劑條件下,,HILIC-B和HILIC-N上出現(xiàn)分裂峰, HILIC-A峰形很差,。當(dāng)乙腈的濃度大于60%,,峰形得到顯著的改善。扁桃酸的峰形在HILIC-B和HILIC-N相上受稀釋劑的影響較小,,而對于HILIC-A相,,在高水濃度下峰形較差??偟膩碚f,,從這個數(shù)據(jù)集合來看,對于這個應(yīng)用,,樣品推薦使用由60-80%有機相組成的稀釋劑。
圖2:次黃嘌呤,、酪胺和扁桃酸在(a)ACE 5 HILIC-N、(b)ACE 5 HILIC-A,、(c)ACE 5 HILIC-B,,150 x 4.6mm。在乙腈:水(90:10 v/v)甲酸銨調(diào)溶液pH 3.0,。流速:1.5mL/min,。溫度:25℃。檢測器:UV,,254nm,。進樣量:5uL。
結(jié)論:
樣品稀釋劑的選擇對峰形和方法有重要影響,。一般來說,,就是樣本稀釋劑應(yīng)由盡可能高比例的較弱的流動相溶劑(HILIC模式中通常是乙腈)組成,。應(yīng)盡可能避免使用含高比例水的樣品稀釋劑。對于一個給定的應(yīng)用,,一個系統(tǒng)的樣品稀釋劑評估,,可以幫助消除任何不良峰形的影響。