菲羅門色譜柱可分為填充柱和開管柱兩大類,。
多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤管形,、U形管等形狀,。液相色譜通常均采用填充柱。
菲羅門色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相,,以及色譜柱的制備和操作條件,。
菲羅門色譜是一種分離分析手段,分離是核心,,因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟,。
對菲羅門色譜柱的要求是柱效高、選擇性好,,分析速度快等,。
市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁,、有機聚合物微球(包括離子交換樹脂),、多孔碳等,其粒度一般為3,5,7,10μm等,,柱效理論值可達5~16萬/米,。
對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效;對于同系物分析,,只要500即可,;對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達2萬的柱子,因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要,。
柱效受柱內(nèi)外因素影響,,為使色譜柱達到最佳效率,除柱外死體積要小外,,還要有合理的柱結(jié)構(gòu)(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術(shù),。
即使最好的裝填技術(shù),在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的,,靠近管壁的部位比較疏松,,易產(chǎn)生溝流,流速較快,,影響沖洗劑的流形,,使譜帶加寬,這就是管壁效應(yīng),。
這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度,。
在一般的液相色譜系統(tǒng)中,柱外效應(yīng)對柱效的影響遠遠大于管壁效應(yīng),。
在選擇菲羅門液相色譜柱之前,,先多了解自己的樣品和雜質(zhì),他們的類型結(jié)構(gòu)、極性,、酸堿性,、分子量大小等等。
1,、樣品是極性的且弱酸性的,;就可以選擇C18在100%酸性水溶液條件下檢測,即要選擇承受100%純水且對極性化合物保留很好的色譜柱,。
2,、如果樣品極性太強,或酸性太強,;可以選擇CN,,NH2,或硅膠柱,,HILIC(親水色譜),,也有使用C18+強陰離子對試劑或強陰離子交換色譜柱(缺點是離子對試劑平衡時間長,對流動相pH要求比較精密,,否則很難重復(fù)實驗,另外離子對試劑很難洗下來,,基本上用了離子對的色譜柱就不能再用于其它實驗)
3,、若樣品是堿性的;可選擇高純硅膠柱(高純硅膠缺少金屬雜質(zhì),,且硅膠端基封尾)或一些經(jīng)過修飾的C18柱(如極性嵌入技術(shù)或堿去活技術(shù)等),,他們都會減少堿性化合物的拖尾,一般會選擇中性或偏堿的條件下做,,因為這樣可增加堿性樣品的保留,。
4、如果堿性化合物的極性太強,,或堿性太強,;可以選擇寬pH的C18色譜柱在高pH值檢測(優(yōu)點是方法開發(fā)簡單,缺點是目前實現(xiàn)這一技術(shù)的色譜柱品牌比較少,,價格也高)或者選用HILIC色譜柱(硅膠柱在反相條件下使用,,這也是很經(jīng)典的檢測堿性樣品的方法)選擇強離子交換柱(缺點是不能用來分析其它樣品,對流動相pH要求比較精密,,否則很難重復(fù)實驗)也有使用C18+強陰離子對試劑或強陰離子交換色譜柱,。