菲羅門色譜柱可分為填充柱和開管柱兩大類,。
多為金屬或玻璃制作,。有直管形、盤管形,、U形管等形狀,。液相色譜通常均采用填充柱,。
菲羅門色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相,,以及色譜柱的制備和操作條件。
菲羅門色譜是一種分離分析手段,,分離是核心,,因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。
對(duì)菲羅門色譜柱的要求是柱效高,、選擇性好,,分析速度快等。
市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相,、氧化鋁,、有機(jī)聚合物微球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等,,其粒度一般為3,5,7,10μm等,,柱效理論值可達(dá)5~16萬/米。
對(duì)于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效,;對(duì)于同系物分析,,只要500即可;對(duì)于較難分離物質(zhì)對(duì)則可采用高達(dá)2萬的柱子,,因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要,。
柱效受柱內(nèi)外因素影響,為使色譜柱達(dá)到最佳效率,,除柱外死體積要小外,,還要有合理的柱結(jié)構(gòu)(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術(shù)。
即使最好的裝填技術(shù),,在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的,,靠近管壁的部位比較疏松,易產(chǎn)生溝流,,流速較快,,影響沖洗劑的流形,使譜帶加寬,,這就是管壁效應(yīng),。
這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。
在一般的液相色譜系統(tǒng)中,柱外效應(yīng)對(duì)柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng),。
在選擇菲羅門液相色譜柱之前,,先多了解自己的樣品和雜質(zhì),他們的類型結(jié)構(gòu),、極性,、酸堿性、分子量大小等等,。
1,、樣品是極性的且弱酸性的;就可以選擇C18在100%酸性水溶液條件下檢測(cè),,即要選擇承受100%純水且對(duì)極性化合物保留很好的色譜柱,。
2、如果樣品極性太強(qiáng),,或酸性太強(qiáng),;可以選擇CN,NH2,,或硅膠柱,,HILIC(親水色譜),也有使用C18+強(qiáng)陰離子對(duì)試劑或強(qiáng)陰離子交換色譜柱(缺點(diǎn)是離子對(duì)試劑平衡時(shí)間長,,對(duì)流動(dòng)相pH要求比較精密,,否則很難重復(fù)實(shí)驗(yàn),另外離子對(duì)試劑很難洗下來,,基本上用了離子對(duì)的色譜柱就不能再用于其它實(shí)驗(yàn))
3,、若樣品是堿性的;可選擇高純硅膠柱(高純硅膠缺少金屬雜質(zhì),,且硅膠端基封尾)或一些經(jīng)過修飾的C18柱(如極性嵌入技術(shù)或堿去活技術(shù)等),,他們都會(huì)減少堿性化合物的拖尾,一般會(huì)選擇中性或偏堿的條件下做,,因?yàn)檫@樣可增加堿性樣品的保留,。
4、如果堿性化合物的極性太強(qiáng),,或堿性太強(qiáng),;可以選擇寬pH的C18色譜柱在高pH值檢測(cè)(優(yōu)點(diǎn)是方法開發(fā)簡單,缺點(diǎn)是目前實(shí)現(xiàn)這一技術(shù)的色譜柱品牌比較少,,價(jià)格也高)或者選用HILIC色譜柱(硅膠柱在反相條件下使用,,這也是很經(jīng)典的檢測(cè)堿性樣品的方法)選擇強(qiáng)離子交換柱(缺點(diǎn)是不能用來分析其它樣品,對(duì)流動(dòng)相pH要求比較精密,,否則很難重復(fù)實(shí)驗(yàn))也有使用C18+強(qiáng)陰離子對(duì)試劑或強(qiáng)陰離子交換色譜柱,。