蛋白質(zhì)氧化 - 蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南

在氧化環(huán)境條件下,，盡管蛋白質(zhì)的幾個氨基酸都可能受影響,，但最有可能被氧化的氨基酸是甲硫氨酸,；甲硫氨酸可被氧化成甲硫氨酸亞砜（圖34）,。
對甲硫氨酸殘基的氧化取決于其在蛋白質(zhì)中的位置,。埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的甲硫氨酸不可能被氧化,。接近表面且與溶劑接觸的甲硫氨酸側(cè)鏈最有可能被氧化,。
氧化條件包括熱,、過渡金屬的存在以及溶液中氧氣的存在,。
同脫酰胺作用一樣,，甲硫氨酸的氧化可能導致生物活性的喪失或減弱，或者,，在一些情況下對生物活性無影響,。
這取決于甲硫氨酸在蛋白質(zhì)中的位置。但另一方面，甲硫氨酸亞砜的存在說明蛋白質(zhì)經(jīng)受過氧化條件,，因此甲硫氨酸氧化可以指示蛋白質(zhì)經(jīng)受過脅迫條件,。

圖34. 在氧化環(huán)境條件下，甲硫氨酸被氧化為甲硫氨酸亞砜,。

圖35. 天然蛋白水解產(chǎn)生的重組人凝血因子VIIa的一氧化物和二氧化物的反相色譜法分離,。

條件

色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米

流動相：37~47% 乙腈-0.1% TFA體系,，30分鐘梯度洗脫,。

樣品：被過氧化氫部分氧化的重組人凝血因子 VIIa。

通常會監(jiān)測蛋白質(zhì)治療藥物的氧化反應(yīng),，因為它既可能影響生物活性,，也可作為一種指示。
甲硫氨酸的氧化反應(yīng)會導致蛋白質(zhì)疏水性下降,，因此在反相HPLC中,，氧化蛋白會先于天然蛋白洗脫出來，如圖35所示,。
重組人凝血因子VIIa（rCF VIIa）被過氧化氫部分氧化后利用反相HPLC對溶液進行分析,。
氧化蛋白（兩個甲硫氨酸殘基被氧化）先洗脫出來。
只有一個甲硫氨酸被氧化的兩種蛋白隨后洗脫出來,，最后是天然蛋白,。四種蛋白具有良好的分辨率。
尤其是只有一個甲硫氨酸被氧化的兩種蛋白間分辨率很高,。這幾種蛋白均有一個氧化甲硫氨酸,，僅區(qū)別于被氧化甲硫氨酸的不同。

通常利用肽圖監(jiān)測甲硫氨酸的氧化,。
如圖36所示,，含氧化甲硫氨酸的多肽比含天然甲硫氨酸的多肽出峰時間早很多。
T2 metox 先于天然T2胰蛋白酶水解片段洗脫出來,；T11 metox先于天然 T11洗脫出來,，使得鑒別和監(jiān)測更容易。

圖36. 部分氧化的人生長激素的肽圖,。

條件

色譜柱：C18寬孔柱,，4.6 x 250 mm

流動相：0~40% 乙腈—0.1% TFA體系，梯度洗脫,，120分鐘,。